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新型冠狀病毒患者的淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子檢測生物安全性建議
（一）微生物學(xué)
2019 新型冠狀病毒是人類分離的第七類冠狀病毒。該病毒屬于β屬，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑 60-140nm。其基因特征與 SARS-CoV 和 MERS-CoV 有明顯區(qū)別。目前研究顯示與蝙蝠 SARS 樣冠狀病毒（Bat-SL-CoV ZC45）同源性達(dá) 85%以上。目前已經(jīng)獲得該病毒的全基因組序列、電鏡照片，體外分離培養(yǎng)已經(jīng)成功。
對冠狀病毒理化特性的認(rèn)識多來自對 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的研究。病毒對紫外線和熱敏感，56℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒。氯己定不能有效滅活病毒。
（二）流行病學(xué)及安全原則
1、呼吸道標(biāo)本（鼻咽拭子、咳痰、抽吸痰、BALF、PSB、組織等）含有病毒，有傳染性。部分患者，尤其是危重型患者，會有病毒血癥。病毒血癥時的血液標(biāo)本，有傳染性。部分患者有腹瀉癥狀，糞便標(biāo)本已證實有病毒分離，按有傳染性處理。胸腔積液少見，尚未證實胸腔積液標(biāo)本的傳染性，建議按有傳染性處理。
2、尚無病毒載量信息的標(biāo)本：尿液、胸腔積液之外的其他正常無菌體液（腦脊液、心包積液、腹腔積液、后穹隆穿刺液、關(guān)節(jié)液）、腹膜透出液、精液、女性生殖道分泌物等，建議目前按有傳染性處理。
3、傳播途徑：目前明確的途徑包括呼吸道飛沫傳播、氣溶膠傳播、接觸傳播。糞便已有病毒分離，不除外其他傳播途徑。
防止氣溶膠傳播感染：在采血過程中、使用注射器、離心、拔帽、加樣、全自動儀器設(shè)備工作等過程中均可產(chǎn)生氣溶膠，由于許多患者及其標(biāo)本含有病原微生物，在產(chǎn)生大量氣溶膠并擴(kuò)散到空氣中時，可污染實驗室的空氣；這些包含病原微生物的氣溶膠粒子可能會被操作者吸入、或粘附在裸露的皮膚衣物上、或粘附于隨處亂放的手機(jī)等物品上、或飛入水杯中等等；因此，這種污染空氣的現(xiàn)象還是普遍存在的。本實驗過程中不可避免的產(chǎn)生氣溶膠，須注意氣溶膠的安全防護(hù)。產(chǎn)生氣溶膠的操作包括：流式管加入樣本和試劑后以及加入溶血素后的渦旋震蕩及離心都可產(chǎn)生氣溶膠。防止氣溶膠污染，則個人必須按三級生物安全防護(hù)。
4、未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料操作：如不能可靠滅活，進(jìn)行病毒抗原檢測、血清學(xué)檢測、生化分析等操作時應(yīng)在生物安全二級實驗室開展，盡可能在生物安全柜中進(jìn)行，個人采用三級生物安全防護(hù)。
5、確診患者標(biāo)本，建議三級生物安全防護(hù)。一般患者，發(fā)熱狀態(tài)和疑似患者標(biāo)本，可以二級生物安全防護(hù)，或在此基礎(chǔ)上適度加強(qiáng)。
（三）待測樣品的生物安全預(yù)處理：
產(chǎn)品試劑盒中不含殺滅病毒的組分。相關(guān)指南中指出病人的痰液、咽拭子、下呼吸道標(biāo)本（如氣管分泌物、氣管吸取物、肺泡灌洗液）、血清，血漿，全血，糞便等都是含有病毒的感染源。固在未有臨床明確診斷前，感染者和非感染者難以區(qū)分，應(yīng)將所有樣本視為具有感染性。
《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》中指出：病毒在4℃合適維持液中為中等穩(wěn)定，－60℃可保存數(shù)年，新冠狀病毒對熱敏感，保持56℃-30分鐘，紫外線、乙醚、來蘇水、75%乙醇、含氯消毒劑、甲醛、0.1%過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，但氯已定不能有效滅活病毒。冠狀病毒不耐酸、不耐堿，病毒復(fù)制的最適宜pH為7.2。
因白細(xì)胞分化抗原和細(xì)胞因子屬于生物蛋白質(zhì)分子，上述推薦殺滅病毒的處理方法會破壞其生物活性和結(jié)構(gòu)，干擾試劑檢測結(jié)果。且紫外線只適用于殺滅表面病毒，因此不能有效殺滅待測外周血樣本中病毒。綜合現(xiàn)有診療方案及相關(guān)指南中提到滅活病毒方法，都不適用于檢測淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子等血液標(biāo)本預(yù)處理。目前尚無實驗室已驗證并可有效滅活流式檢測血液血樣本的冠狀病毒的方法。
因此應(yīng)在生物安全二級實驗室開展，盡可能在生物安全柜中進(jìn)行。操作過程須打開樣本試管塞，可能產(chǎn)生氣溶膠，或可能接觸標(biāo)本本身，個人按則按三級生物安全防護(hù)。
（四）檢測中的生物安全性防護(hù)
因病毒可能的傳播途徑包括飛沫傳播、糞口傳播以及接觸傳播。在處理含病毒的血液本（包括未知高危樣本）應(yīng)在生物安全二級及以上實驗室條件下進(jìn)行。1、標(biāo)本離心：操作者不能離開離心機(jī)。如果疑似意外，比如離心過程有異常聲響，則停 止離心。改為三級生物安全防護(hù)后，停止離心 30min 以上，小心開蓋，75%乙醇噴霧消毒后 進(jìn)行處理。盡可能在生物安全柜中將離心管放入和取出轉(zhuǎn)子。標(biāo)本離心無意外，離心停止10min以上，開離心機(jī)蓋噴霧消毒。按檢測項目和工作分工，將標(biāo)本送抵相應(yīng)實驗區(qū)操作臺“未檢標(biāo)本處”。
2、檢測樣本制備過程：應(yīng)在二級生物安全柜（按ABSL-2防護(hù)水平要求）中進(jìn)行操作，遵守相關(guān)操作規(guī)程，使用有蓋的流式檢測管。操作過程中，操作者輕柔緩慢打開采血樣本管蓋和流式管蓋，操作者須三級生物安全防護(hù)。盡可能地使用一次性器具，生物安全柜內(nèi)75%酒精消毒和紫外線照射。
3、流式細(xì)胞儀檢測：上機(jī)前輕柔緩慢打開流式管蓋，和操作者面部保持距離，打開試管塞后，則消毒蓋子后棄去，操作者須三級生物安全防護(hù)。
4、個人防護(hù)：參見《新型冠狀病毒感染的肺炎防控中常見醫(yī)用防護(hù)用品使用范圍指引（試行）》（2020.1.26），如下：
1）防護(hù)用品：醫(yī)用外科口罩（YY0469-2011）、醫(yī)用防護(hù)口罩(GB19083-2010)、N95（美 國 NIOSH42CF R84-1995）（下文行文包括 KN95[GB2626-2019]）、全面型呼吸防護(hù)器、防護(hù) 服、隔離衣、工作服、乳膠手套、醫(yī)用防護(hù)帽、護(hù)目鏡、防護(hù)面具或防護(hù)面屏、鞋套和防水高靴。
2）二級生物安全防護(hù)：醫(yī)用防護(hù)口罩或 N95 口罩、乳膠手套、工作服外隔離衣、醫(yī)用防護(hù)帽，加手衛(wèi)生。酌情（比如有噴濺風(fēng)險）可加護(hù)目鏡。
3）三級生物安全防護(hù)：醫(yī)用防護(hù)口罩或 N95、單或雙層乳膠手套（條件許可，可以不同顏色）、面屏、護(hù)目鏡、工作服外防護(hù)服、單或雙層醫(yī)用防護(hù)帽，加手衛(wèi)生。必要時雙層口罩（外醫(yī)用防護(hù)口罩，內(nèi) N95）。
4）佩戴注意事項：外科口罩佩戴時，雙手沿鼻沿壓緊貼合。所有口罩戴上后確認(rèn)密封；摘下時不要觸碰正面。防護(hù)服脫之前，全身噴霧消毒（比如有效氯濃度 500mg/L 消毒劑），按標(biāo)準(zhǔn)流程依次脫個人生物安全防護(hù)裝備，污染面切勿接觸內(nèi)部衣物。
5）紫外：符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（紫外線殺菌燈 GB 19258-2012）。定期檢測性能、完整記錄、累積使用不超過規(guī)定時限。消毒時間不少于 30min。
6）消毒液：每天試驗前后使用 500mg/L 有效氯的消毒液（84消毒液100 倍稀釋）或 75%乙醇進(jìn)行桌面、臺面及地面消毒。消毒液新鮮配置，不超過24小時。
7）儀器消毒：移液器以及漩渦震蕩儀器使用75%乙醇消毒，操作后流式細(xì)胞儀用75%乙醇沖洗30分鐘。
8）環(huán)境：實驗區(qū)符合二級或三級生物安全實驗室規(guī)范。
（五）廢棄物處理
對檢測完成后的疑似病人樣本采用雙層塑料袋密封；對實驗過程中產(chǎn)生的廢液和槍頭等置于含0.5%～1%有效氯的含氯消毒液的廢液缸。上述物品經(jīng)壓力蒸汽滅菌處理。詳見《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》（第三版）。
（六）樣本的運輸
標(biāo)本采集、運送、存儲和檢測暫按二類高致病性病原微生物管理，按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》及《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（衛(wèi)生部令第45號）的要求執(zhí)行
（七）生物安全柜操作注意事項：
⑴風(fēng)機(jī)運行至少5min后方可開始操作；
⑵柜內(nèi)盡量少放物品，以免影響氣流循環(huán)；
⑶避免干擾氣流，不良行為包括手臂頻繁出入，操作者身后人員頻繁走動，阻擋空氣格柵；
⑷在中后部操作，并不影響透過玻璃擋板觀察；
⑸柜內(nèi)不可進(jìn)行文字工作；
⑹風(fēng)機(jī)運行至少5 min后方可關(guān)機(jī)；
⑺工作完成后、每天下班前，使用適當(dāng)消毒劑擦拭表面。
參考資料：
1.國家衛(wèi)生健康委2020年1月28日發(fā)布《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢檢測技術(shù)指南（第三版）》
2.中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會2020年1月30日發(fā)布《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室檢測的生物安全防護(hù)指南》
3. 《新型冠狀病毒感染的肺炎防控中常見醫(yī)用防護(hù)用品使用范圍指引（試行）》（2020.1.26）
4. 《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》（第三版）
5. 《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》
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