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γ干擾素釋放分析T-SPOT.TB診斷結核感染臨床應用
結核病是全球嚴重的公共衛生問題之一。據WHO估計, 全球有約20 億人感染結核分枝桿菌,每年有約200萬人死于結核。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一, 結核感染導致的死亡人數是其他傳染性疾病總死亡人數的2倍以上。結核病的臨床表現多樣, 可以累積全身各個系統, 尤其是肺外結核病變往往十分隱匿, 給臨床診斷帶來極大的困難。結核菌素皮試(tuberculin skin test, TST)是長期以來用以快速診斷結核感染的唯一手段。然而TST 存在諸多缺陷: 在易受結核感染的免疫力低下人群中, 其敏感性反而大大降低; 結核菌素純蛋白衍生物(purified prote in derivatives, PPD)是200多種蛋白的混合物, 其中很多是非結核分枝桿菌及卡介苗(Bacillus Calmette-Gurin, BCG)的共同抗原成分, 在普遍接種BCG 的地區造成非常高的“假陽性”率。此外, 皮試的操作和結果的解釋存在主觀依賴性, 降低了檢查的準確性。T-SPOT.TB 是以特異性抗原為刺激源, 應用酶聯免疫斑點技術(enzym e-linked mimunospot assay,ELISPOT)診斷結核感染的新方法。
結核分枝桿菌感染后機體的免疫應答根據結核感染的狀態, 人群可以分為無結核感染、活動性結核、潛伏性結核和治愈。結核分枝桿菌是胞內寄生菌, 侵入機體后, 首先引起固有免疫反應, 被巨噬細胞吞噬。在大多數感染者中, 單純的固有免疫并不足以抑制結核分枝桿菌的生長增殖。被感染的巨噬細胞凋亡后, 釋放出大量特異性抗原,可被樹突狀細胞加工呈遞給特異性的CD4、CD8和CDT 細胞, 以及CD1限制性T 細胞, 繼而引發獲得性免疫。CD4 T 細胞在結核免疫防御機制中發揮主要作用, 特異性的CD4 T 細胞與抗原肽-主要組織相容性復合體2類分子復合物結合后被激活, 分泌C干擾素, 從而激活巨噬細胞發揮抗結核活性。特異性CD8 T 細胞產生效應因子腫瘤壞死因子A和干擾素C并釋放顆粒酶和穿孔素溶解感染細胞, 同時啟動Fas途徑發揮其溶細胞作用。γ干擾素是結核分枝桿菌感染后機體免疫應答中最重要的細胞因子。在大多數免疫力正常的感染者中, 獲得性免疫能夠控制卻不足以清除結核感染, 吞噬了結核分枝桿菌的巨噬細胞被纖維包裹形成肉芽腫而使感染局限, 這時機體呈現一種無癥狀的潛伏性感染狀態, 而結核特異性的中央型記憶細胞(CCR7+CD27+)和效應型記憶細胞(CCR7-CD27-)在機體中長期存在。潛伏性結核感染者一生中有10% 的可能發生結核病, 約5% 在兩年內復發表現為活動性結核,另有5% 將在此后的時間內復發。由于潛伏感染者的體內長時間存留活菌, 當出現各種原因導致機體的免疫力低下時,結核復發的風險顯著增加,如結核合并人免疫缺陷病毒(human mimunodeficiency virus,HIV)感染時, 發展為活動性結核的風險將增加至每年10%。
T-SPOT.TB的原理及結果判斷
T-SPOT.TB是以ELISPOT 技術檢測結核感染的新方法, ELISPOT 技術是近20年發展起來的檢測抗原特異性T細胞的技術, 是目前最敏感的檢測抗原特異性T細胞的方法之一, 可以檢測出1 /100 000~1 /50 000外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中經某種抗原刺激后釋放某種細胞因子的細胞, 經過酶聯顯色后, 通過ELISPOT分析系統(ELISPOT Reader)對斑點進行計數,1個斑點代表1個細胞, 從而計算出抗原特異性細胞的頻率。T-SPOT.TB 的產生得益于基因分子生物學和免疫學的進展。1999年, Behr等應用基因芯片技術將結核分枝桿菌標準株H37Rv和BCG的全基因組進行比較, 結果顯示129個只特定存在于結核分枝桿菌而在BCG中缺失的開放讀碼框, 這些在BCG中缺失的部分被劃分為16個區域, 命名為RD1 ~RD16, 其
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